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B6-Ntcptm1(hNTCP)小鼠,動物試驗

原創(chuàng)發(fā)布者：北檢院發(fā)布時間：2023-02-27 點擊數(shù)：

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基本信息

品系名稱：B6-Ntcp^tm1(hNTCP)小鼠

英文名稱：B6-Ntcp^tm1(hNTCP)

疾病名稱：免疫缺陷疾病

相關(guān)基因：NTCP

背景品系：C57BL/6J小鼠

遺傳類型：基因敲入近交系

繁殖方式：HOM X HOM

繁殖代數(shù)：6代

研究用途：用于乙肝病毒方面研究。

飼養(yǎng)環(huán)境：屏障設(shè)施

培育單位：北京華阜康生物科技股份有限公司

保種單位：北京華阜康生物科技股份有限公司

資源鑒定：已通過實驗動物模型鑒定與評價工作委員會鑒定

鑒定日期：2020-04-29 00:00:00

特征描述

NTCP小鼠是北京華阜康生物科技股份有限公司自主研發(fā)的免疫模型小鼠，在小鼠的基因組插入了人源化的NTCP基因，構(gòu)建乙肝病毒易感的NTCP小鼠模型，為深入研究乙肝病毒的發(fā)病機制提供理想的小鼠模型。

鈉離子-?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運蛋白（Sodium Taurocholate Cotransporting Protein, NTCP）屬于溶質(zhì)運載蛋白家族，是一種鈉離子依賴的?；悄懰徂D(zhuǎn)運蛋白，主要在在肝細(xì)胞表面表達(dá)，負(fù)責(zé)肝臟內(nèi)的膽酸轉(zhuǎn)運，膽汁酸排入小腸后，大部分被重吸收，通過NTCP被攝入肝細(xì)胞內(nèi)，再次被分泌到膽汁中，形成膽汁酸的肝腸循環(huán)。

2012年11月北京生命科學(xué)研究所（NIBS）李文輝團隊研究發(fā)現(xiàn)，NTCP是一種主要的HBV/HDV功能性受體。NTCP表達(dá)水平的下調(diào)或沉默會降低HBV或HDV（帶有HBV外膜蛋白）在易感細(xì)胞中的感染水平。發(fā)現(xiàn)NTCP扮演HBV侵染過程中的受體蛋白的角色解決了HBV研究領(lǐng)域的一個基礎(chǔ)問題。

目前越來越多治療乙肝的新藥把NTCP作為治愈乙肝的潛在靶標(biāo)，比如Myrcludex B、環(huán)孢菌素A（CyclosporinA）及其衍生物SCYX1454139，都是通過NTCP來阻斷HBV進入肝細(xì)胞。而人（hNTCP）與小鼠（mNTCP）在157-165肽段具有極高同源性，但是由于84-87肽段的差異導(dǎo)致mNTCP仍然不能支持HBV/HDV的侵染；將84-87肽段置換為hNTCP的對應(yīng)區(qū)段的mNTCP能夠支持HepG2細(xì)胞被HBV/HDV感染，此模型鼠就是將人源的NTCP插入到小鼠NTCP位點上，破壞掉小鼠本身的NTCP，引入人源NTCP序列而制備的。

動物簡介

NTCP小鼠是通過CRISPR-Cas9技術(shù)對在C57BL/6J背景插入人源化的NTCP基因而獲得純合突變小鼠。

營養(yǎng)成分

粗蛋白≥23.0%、粗脂肪≥5.0%、粗灰分≤7.0%、粗纖維≤5.0%、水份≤10%、鈣1.4%～1.5%、磷1.0%～1.1%、賴氨酸≥1.32%、蛋氨酸+胱氨酸≥0.78%

生物學(xué)特性

1. 生長曲線

2、解剖學(xué)特性與背景品系C57BL/6J相同。3、繁殖特性純合子之間同胞兄妹間繁殖，繁殖能力一般，每胎產(chǎn)5-7只。4、自發(fā)異常

不規(guī)則脾脾臟黑色素沉積

遺傳信息

1、NTCP小鼠的制備背景小鼠C57BL/6J為近交系小鼠，是經(jīng)過全基因組測序的小鼠，具有實驗結(jié)果精度高、可比性好、應(yīng)激反應(yīng)均一等特點，是基因工程小鼠常用品系。基因設(shè)計信息 NTCP的信息及研究背景 Slc10a1 solute carrier family 10 (sodium/bile acid cotransporter family), member 1 [ Mus musculus (house mouse) ]

Gene ID: 20493

該基因完整的CDNA序列如下：>hNTCP (1050bp)ATGGAGGCCCACAACGCGTCTGCCCCATTCAACTTCACCCTGCCACCCAACTTTGGC

AAGCGCCCCACAGACCTGGCACTGAGCGTCATCCTGGTGTTCATGTTGTTCTTCATC

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CAGCCTAG 1.1 Donor質(zhì)粒設(shè)計及構(gòu)建質(zhì)粒人NTCP基因與小鼠的3’-UTR連接設(shè)計donor，形成hNTCP-mUTR，用人源的hNTCP-mUTR替換小鼠基因，形成M-donor-hNTCP-mUTR。

1.2 載體構(gòu)建 ①sgRNA 載體載體名稱：pUC57-sgRNA expression vector Addgene ID: 51132 根據(jù)基因信息選擇靶點，合成sgRNA（上海英濰捷基） Targeting site 1GGGTACGAGCTCCACTCGGC AGGM- NTCP-EBe1-gRNA up: TAGGGTACGAGCTCCACTCGGCM- NTCP-EBe1-gRNA down: AAACGCCGAGTGGAGCTCGTAC Targeting site 2GGACCGAGGGTTAAGAGGAA AGGM- NTCP-EAf1-gRNA up: TAGGACCGAGGGTTAAGAGGAAM- NTCP-EAf1-gRNA down: AAACTTCCTCTTAACCCTCGGT合成的sgRNA單鏈通過退火復(fù)性結(jié)合成小片段，插入BSAⅠ線性化的載體sgRNA插入位點示意圖

構(gòu)建完成的sgRNA載體通過體外轉(zhuǎn)錄成為可注射的sgRNA。（體外轉(zhuǎn)錄用試劑盒：Ambion Am1354） ②doner設(shè)計>hNTCP (1050bp)ATGGAGGCCCACAACGCGTCTGCCCCATTCAACTTCACCCTGCCACCCAACTTTGGCAAGCGCCCCACAG

ACCTGGCACTGAGCGTCATCCTGGTGTTCATGTTGTTCTTCATCATGCTCTCGCTGGGCTGCACCATGGA

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TGCTATGAGAAATTCAAGACTCCCAAGGATAAAACAAAAATGATCTACACAGCTGCCACAACTGAAGAAAC

AATTCCAGGAGCTCTGGGAAATGGCACCTACAAAGGGGAGGACTGCTCCCCTTGCACAGCCTAG小鼠的3’-UTRAATGTGAAAACTTAGAAGCAACAAGGAAAGTAACACCTAGTGTGCCAGATTGTCTAGCACTTCCAGCAAAC

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TTCTCTCTGCTCTCTTCTGCCTCAATGGACGGTGCAGACGCACTGTCAGCATGGAGACTGGATGCCAAAATG

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CTCCCAAGGATAAAACAAAAATGATCTACACAGCTGCCACAACTGAAGAAACAATTCCAGGAGCTCTGGGAAA

TGGCACCTACAAAGGGGAGGACTGCTCCCCTTGCACAGCCTAGAATGTGAAAACTTAGAAGCAACAAGGAAAG

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GGCAGAAGGGCATCTATCCAGGAACCATCATCCATCCCCAAAAATCTGCTATTTGTTTAAAAGATAAAAAAGAA

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GTAACTCAAAAGGAAATAAACTACAACTGGTAGTTCTAACTTACCAAAC 小鼠基因組序列attattttttttacctggtgcatctcaagcttgctacaacctcacttccttctctgaagtctctcaagttatggatacctcaggcaccagctagttactctc

cacagctggagtttctcgtgagctgggctttggataatctccaggcttccaagagcccaacgtaccccagaaagttttttcccctctggagataagt

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cagcctggtctacaaagtgagttccaggacagtcaggactataca 用人源的hNTCP-mUTR替換上述下滑線序列，包含一處點突變，命名為M-donor-hNTCP-mUTR>M-donor-hNTCP-mUTRAttattttttttacctggtgcatctcaagcttgctacaacctcacttccttctctgaagtctctcaagttatggatacctcaggcaccagctagttactct

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acaaagtgagttccaggacagtcaggactataca ③ CAS9 載體載體名稱：pST1374-NLS-flag-linker-Cas9Addgene ID: 44758載體通過體外轉(zhuǎn)錄成為可注射的Cas9-RNA（體外轉(zhuǎn)錄用試劑盒：Ambion Am1345） 1.3顯微注射①超數(shù)排卵：150只3-4周齡c57雌鼠注射激素進行超排。②受精卵注射：取約350枚受精卵進行注射。③雄鼠結(jié)扎：制作30只8周齡輸精管結(jié)扎的c57雄鼠。④受體鼠制備：8-10周齡ICR雌鼠與結(jié)扎的ICR雄鼠交配后選取見栓的雌鼠。⑤胚胎移植：將注射后的受精卵移植到受體鼠輸卵管壺腹部（移植一次， 350枚卵，15只受體鼠）。