NSIG小鼠是通過利用CRISPR/Cas9 技術(shù)，對NODSCID小鼠的IL2rg基因進(jìn)行靶向敲除制備而成。 表現(xiàn)為T、B、NK細(xì)胞嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷。

粗蛋白≥23.0%、粗脂肪≥5.0%、粗灰分≤7.0%、粗纖維≤5.0%、水份≤10%、 鈣1.4%～1.5%、磷1.0%～1.1%、賴氨酸≥1.32%、蛋氨酸+胱氨酸≥0.78%

1、生長曲線

2、解剖學(xué)特性

無胸腺胸腺正常的動(dòng)物（左）與NOD SCID（右）

3、繁殖特性同胞兄妹交配繁殖方式，繁殖能力較強(qiáng)，每胎產(chǎn)7-10只。4、自發(fā)異常

胸腺瘤（左：正常NOD SCID,右：胸腺瘤NOD SCID）

5、血液學(xué)指標(biāo)

NOD SCID小鼠血生理指標(biāo)

NOD SCID小鼠血生化指標(biāo)

Prkdc（protein kinase, DNA-activated, catalytic polypeptide）基因是淋巴細(xì)胞發(fā)育過程中V（D）J區(qū)段重組的必須蛋白激酶的編碼基因，Prkdcscid是Prkdc基因點(diǎn)突變，此突變可導(dǎo)致蛋白的翻譯功能提前終止。在攜帶Prkdcscid突變的SCID小鼠，其淋巴細(xì)胞發(fā)育過程中，因其抗原受體基因重組障礙，導(dǎo)致其不能正常重組，導(dǎo)致其無法產(chǎn)生正常功能的受體蛋白，使其淋巴細(xì)胞在成熟之前死亡或被機(jī)體清除，表現(xiàn)為缺乏功能性T、B細(xì)胞，無法介導(dǎo)細(xì)胞和體液免疫。

Il2rgnull： Interleukin-2受體的gamma鏈（IL-2R γc，又稱CD132）是重要免疫功能的細(xì)胞因子Il2、Il-4、Il-7、Il-9、Il-15和I-21的共同受體亞基，敲除該基因后的小鼠機(jī)體免疫功能嚴(yán)重降低，尤其是其NK細(xì)胞的活性完全喪失。

1、靶基因位點(diǎn)選擇

設(shè)計(jì)及構(gòu)建質(zhì)粒：

利用CRISPR/Cas9技術(shù)，針對目的基因的插入位點(diǎn)尋找靶序列，根據(jù)靶序列信息設(shè)計(jì)針對該位點(diǎn)的guide RNA，經(jīng)活性檢測后，將具有活性的guide-RNA和Cas9體外轉(zhuǎn)錄成RNA，通過顯微注射將guide-RNA，Cas9 mRNA和重組DNA注射到受精卵中，從后代中篩選獲得陽性小鼠。

M-IL2rg–E1-gRNA up: TAGGATCTGATAATAATACATTCC

M- IL2rg–E1-gRNA down: AAACGGAATGTATTATTATCAGAT

M-IL2rg–E2-gRNA up: TAGGCAACAAATGTCTGGTAGAGC

M- IL2rg–E2-gRNA down: AAACGCTCTACCAGACATTTGTTG

3、 顯微注射及胚胎移植

gRNA經(jīng)體外合成、轉(zhuǎn)錄后與Cas9 RNA一起注射入C57BL/6小鼠受精卵細(xì)胞，受精卵細(xì)胞移植供體ICR小鼠。

經(jīng)過F0代基因型鑒定，獲得2只F0 KO 小鼠（6，8），具體測序結(jié)果見附件，由于敲除片段較小，請輔助測序進(jìn)行進(jìn)行基因型鑒定。目前小鼠可以運(yùn)走。

敲除片段：

6 del 2bp 雜合子

Ggtaggaaacctaggaccagagggagttgttgagaggaaggctatggggaaagggcctgctagtgctcactataatgactaaaacgaagtgtgcagagggggaggggaaggctctctgcctcactgctgcttcttctgaccaag

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8 del 5 bp 雜合子

Ggtaggaaacctaggaccagagggagttgttgagaggaaggctatggggaaagggcctgctagtgctcactataatgactaaaacgaagtgtgcagagggggaggggaaggctctctgcctcactgctgcttcttctgaccaaga

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ataccaggtcccagttctctgccccccaactcctctgtc

敲除后影響翻譯，生成終止密碼子