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基本信息

品系名稱：B6-Mhc1^tm1小鼠

英文名稱：B6-Mhc1^tm1 mouse

疾病名稱：移植排斥、腫瘤

相關基因：beta2m

背景品系：C57BL/6J

遺傳類型：基因敲除

繁殖方式：HOM X HOM

繁殖代數(shù)：NA

研究用途：用于移植排斥、腫瘤、免疫及信號轉(zhuǎn)導方面的研究。

飼養(yǎng)環(huán)境：屏障或隔離環(huán)境

培育單位：北京華阜康生物科技股份有限公司、中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所

保種單位：中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所

資源鑒定：否

鑒定日期：暫無介紹

特征描述

MHC-l抗原加工和呈遞的分子機制研究

1986年，Morrison等發(fā)現(xiàn)抑制溶酶體的蛋白降解過程并不影響MHCI類分子的抗原呈遞，提示細胞質(zhì)中的蛋自酶參與抗原加工。到二十世紀九十年代初期，人們已經(jīng)認識到MIP(MHCl結合抗原多肽)主要來自于細胞質(zhì)中蛋白酶體對細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的降解產(chǎn)物。隨后，Goldberg等研究小組通過使用蛋白酶抑制劑證實了這一猜測，并分析了體外純化蛋白酶的降解產(chǎn)物特征。研究表明，蛋白酶降解產(chǎn)物的長度范圍是3～22氨基酸殘基，呈對數(shù)正太分布。其中70～80％的多肽產(chǎn)物太短，不能作為MHC-I呈遞的抗原肽，約10％的產(chǎn)物長度與MIP一致，為8～l0個氨基酸殘基，剩余酶10～15％產(chǎn)物可以經(jīng)氨肽酶等進一步加工作為MHC-I呈遞的抗原肽。同時，Goldberg等的研究還表明，MHC1結合多肽的羧基末端殘基是由蛋白酶降解過程所確定的，而N端則需要氨肽酶進一步進行加工處理。在這一信息的提示下，2002年有三個實驗室同時發(fā)表論文，分別簽定了小鼠和人類細胞中位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的、參與多肽進一步加工的氨肽酶ER-AAP/ERAP1。

二十整紀九十年代以來，MHC-1的抗原加工和呈遞的分子機制逐漸得到了闡明。1990年，有四個研究小組同時發(fā)表論文，證明染色體的MHC區(qū)存在編碼參與抗原多肽轉(zhuǎn)運的基因，其產(chǎn)物TAP(transporter associated with antigen processing)負責把細胞質(zhì)中的8～15mer多肽轉(zhuǎn)運到ER內(nèi)。1996年，Cresswell研究小組鑒定了Tapasin，發(fā)現(xiàn)tapasin在TAP與MHC-1之間發(fā)回重要的介導作用，并依據(jù)此提出了多肽加載復合物（peptide-loading complex，PLC）的最初模型。近年來，CressweIl小組發(fā)現(xiàn)Tapasin與ERp57形成異二聚體(以二硫鍵結合)，構成了PLC的最小功能單元，起著多肽加載和編輯的重要功能。最近，該實驗室解析了Tapasin-ERp57異二聚體的結構，從而為蛋白酶體-TAP、ERAPl、PLC介導的對胞內(nèi)蛋白的MHC-1直接抗原呈遞途徑提供了更為清晰的圖像。

MHC-I結合多肽(CTL表位)的來源蛋白的研究

早在1989年，Boon等根據(jù)無啟動子DNA分子轉(zhuǎn)化進入細胞后可以被翻譯并由MHC-1分子呈遞多肽片段的實驗觀察，提出了“pepton”假說。該假說認為：(1)含有CTL表位多肽(MIP)的短序列可以自動被轉(zhuǎn)錄、翻譯，(2)MIP可以從基因序列上任意閱讀框內(nèi)含潛在CTL表位區(qū)域(“pepton”)的即時翻譯產(chǎn)物中產(chǎn)生。按照“pepton”假說，MIP可以來自基因三個不同閱讀框的編碼產(chǎn)物。然而，此后發(fā)現(xiàn)的絕大多數(shù)CTL表位都是來自基因的正常閱讀框的產(chǎn)物，因此這一假說很快遭到了質(zhì)疑。此外，人們很快認識到MIP來自于細胞質(zhì)中蛋白酶對細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的降解產(chǎn)物。因此，隨著細胞內(nèi)耗能性蛋白降解研究的進展，主流研究者更加關注泛素介導的蛋白酶研究，認為細胞內(nèi)完成自身使命的蛋白質(zhì)分子(old protein)是MIP的主要來源。

然而考慮到某些病毒在4個小時內(nèi)就能夠完成從入侵細胞、復制病毒到釋放子代病毒顆粒的整個過程，CTL要想控制病毒在體內(nèi)的傳播，必須盡快識別并清除被病毒感染的細胞。例如彈狀病毒或流感病毒在感染細胞后1小時內(nèi)，宿主細胞就可以把病原體來源的MIP呈遞給CD8+T細胞并足以誘導有效的抗病毒細胞免疫應答。病毒來源的蛋白分子在進入MIP庫之前必須成功地與細胞內(nèi)高達3×109個宿主蛋白質(zhì)進行競爭。因此，如果MIP庫僅是由具天然結構的細胞質(zhì)內(nèi)蛋白或多肽經(jīng)蛋白酶體系加工處理而來，則宿主細胞無法在1小時的時間范圍內(nèi)成功地把入侵病毒的抗原呈遞給免疫系統(tǒng)。正是基于上述對病毒復制和蛋白正常代謝進行的動力學分析，Yewdell等人于1996年提出了DRiP假說，并于2006年進行了一次重要補充。按照DRiP假說，構成MIP庫的抗原肽可以來自于蛋白合成過程中新生成的產(chǎn)物，如蛋白合成過程中提前終止的產(chǎn)物、未能正確折疊的全長蛋白質(zhì)缺陷產(chǎn)物，統(tǒng)稱DRiP(defective ribosomal products)。DRiP假說的核心思想是，蛋白合成過程的副產(chǎn)物DRiP構成了MIP的主要來源。以DRiP作為MIP的一個重要來源，可以使宿主免疫系統(tǒng)在第一時間內(nèi)對新合成的蛋白進行免疫監(jiān)測，因此具有進化上的優(yōu)勢?？茖W假說的價值在于其科學預測的能力。根據(jù)DRiP假說，細胞內(nèi)的蛋白合成受到阻斷將會影響MIP的產(chǎn)生。2000年，Yewdell小組和Neefjes小組同時發(fā)表論文，為這一推測提供了直接的證據(jù)。研究表明，蛋白質(zhì)合成的保真性遠低于DNA的復制，其出錯率競高達30％。這就意味著新合成的蛋白質(zhì)有30％是DRiP，來自新合成的蛋白質(zhì)的多肽片段成為TAP的重要底物轉(zhuǎn)運進入ER并進而被MHGI呈遞。2005年，Yewdell小組進一步證明新蛋白的合成與MHC-I的抗原呈遞緊密偶聯(lián)，并據(jù)此進一步發(fā)展了DRiP假說，提出可能存在參與MHGI抗原呈遞的特異性核糖體(所謂的“immunoribosome”)。后者尚有待于進一步的研究。

MHC-I結合多肽(CTL表位)的結構和構成特征的研究

1990年，Rammensee研究小組第一次報道了MHC-I類分子自然呈遞的表位多肽。此后，隨著Sette小組開發(fā)的免疫沉淀分離MHC分子進而酸抽提結合肽的方法的推廣，人們獲得了大量的MHC-I結合肽的序列資料。這些早期研究定義了CTL表位的錨定位點概念，揭示了MHC-I等位基因特異性保守基序的現(xiàn)象，同時也促使人們應用這些信息開始嘗試對新的CTL表位進行預測和鑒定。1996年，sette小組發(fā)現(xiàn)HLA-A3、A11、A31、A*3301以及A*6801的抗原結合部位具有結構相似性，因此可以交叉識別CTL表位，從而可以把這些HLA-I類分子歸納為A3超型。這一發(fā)現(xiàn)的意義在于，人們可以根據(jù)若干不同的I類HLA分子交叉識別的CTL表位定義出彼此共享的超級基序(supemotif)，并根據(jù)超級基序定義HLA超型(supertype)。2008年，Sette小組根據(jù)近10年來不斷積累的HLA與多肽表位的結合數(shù)據(jù)(binging data)，以及大量的MHC相關的數(shù)據(jù)庫資源(如SY-FPEITHI、 HLA Ligand、FIMM、 MHCBN 和IMGT)，對迄今為止鑒定的945種HLA—A、B位點的等位基因進行分析，結果表明，高達85％的HLA 的A、B位點的等位基因(750種)可以歸納入原先定義的9大類超型之中，即：A01、A02、A03、A24、B07(B08)、B27、B44、B58和B62。

MHC-I結合多肽的來源十分多樣。研究表明，在正常細胞表面，約有數(shù)十萬個各類MHC-l分子，呈遞數(shù)千種不同的抗原多肽。早期應用質(zhì)譜分析方法對MHC-I洗脫的多肽混合物進行的分析表明，在單個細胞表面每一種MHC-l分子可能結合有l(wèi)OOO多種不同酶多肽分子，而每MHC-1多肽復合物的拷貝數(shù)為數(shù)百個(少數(shù)可達10000拷貝／細胞)。根據(jù)積累的MlP表位序列資料，人們發(fā)現(xiàn)MIP的源蛋白包括了所有細胞亞結構中的成分(包括細胞核、細胞質(zhì)、細胞表面的穿膜蛋白，甚至包括線粒體基因組編碼的蛋自)、涉及各種細胞功能體系(細胞代謝、生長以及信號轉(zhuǎn)導通路)。這些多肽幾乎是整個細胞內(nèi)所有蛋白質(zhì)的一個抽樣，因此比喻為“基因芯片”。Shastr等認為，從理論上推測細胞內(nèi)的所有蛋白都被MHC-l分子在細胞表面呈遞了多肽片段。

在過去5年中，隨著高通量質(zhì)譜分析技術的發(fā)展以及人類基因組研究的順利完成，人們得以對單一細胞來源的單一MHCl分子的結合肽進行整體分析，從而首次對上述理論推測進行驗證。根據(jù)由此獲得的MHC-I結合多肽的序列從三個方面探討MIP的構成：源蛋白的構成、源蛋白基因在基因組中的分布、源蛋白mRNA的豐度。2004年，Hildebrand等研究了單一表達水溶性HLA-B*1801的B細胞系721.22l，獲得了HLA．B*180l呈遞的200多條結合肽的序列信息。結合人類基因組信息，發(fā)現(xiàn)這些肽的源蛋白分布于細胞內(nèi)所有的亞細胞結構中，參與細胞的各種生理功能體系，其編碼基因隨機分布予各條染色體上。2007年，Rammensee小組研究了腎腫瘤細胞和對應的正常腎細胞的MlP構成和mRNA表達情況，發(fā)現(xiàn)mRNA拷貝數(shù)并不能有效反映衍生的MHC-l結合肽在細胞表面的豐度，從而提示僅從mRNA入手鑒定腫瘤相關CTL表位是不夠的。然而，2008年Fortier等研究了正常的腫瘤小鼠胸腺細胞中MlP的構成，發(fā)現(xiàn)在胸腺細胞中，MIP的構成反映了細胞內(nèi)mRNA的豐度；正常的癌化胸腺細胞MlP差異達25％，其中近一半與源蛋自腫瘤轉(zhuǎn)化有關【1】。

MHC功能研究現(xiàn)狀

MHC基因的作用主要為排異 。 MHC 基因在哺乳類動物 、兩棲類動物及禽類動物的組織移植排斥中起重要作用 ，即在移植過程中表達相同 MHC基因的個體不產(chǎn)生排斥反應 ，反之會產(chǎn)生。 器官移植的排斥反應主要是由供受者之間 MHC基因的差異引起的 ，器官移植時 ，表達相同 MHC 分子的生物個體可以接受彼此的移植器官或組織，而MHC不同的個體間卻具有排斥作用。 將MHC 基因編碼的多肽分子呈現(xiàn)在細胞表面，作為T細胞的識別標志。 MHC 基因還有免疫作用，因為許多與免疫相關的基因都在 M HC位點上 ，MHC 基因上不同的位點決定了 T 細胞會識別不同類型的抗原，I 類位點針對膜結合抗原 ，而 II 類位點主要針對抗原遞呈細胞上的可溶性抗原，利用這一特點在兩棲類動物中，I 類位點的分析多用于與病毒感染相關的研究 ，而 II 類位點的分析多用于體外抵抗真菌 、細菌 、寄生蟲等感染的研究。 在動物的免疫遺傳學上M HCI 對于了解動物發(fā)病 、育種和疫苗功效等方面具有很高的參考價值 。 研究表明到目前為止在人、老鼠 、雞和牛體內(nèi) ，MHCI與疾病的抗性 、易感性和發(fā)病過程是有密切的聯(lián)系的 。 MHC 基因具有跨種間多態(tài)性 ，因此 MHC 位點在闡明近緣物種間的系統(tǒng)發(fā)生關系時起非常大的作用 ，在動物的系統(tǒng)發(fā)生中 ，MHC分子大約在 4-5 億年前在低等脊椎動物中出現(xiàn)，并開始分化，因此 MHC 位點已經(jīng)作為一種遺傳標記用于調(diào)查種群遺傳結構 ，確定近緣物種間的關系和進化歷史；MHC基因又與抗病相關。 在各基因座都存在著眾多的復等位基因 ，與此同時 ，高度的變異導致了抗原結合多肽的多樣性，而這種多樣性與動物機體的抗病能力有一定的關系，在許多物種中都已經(jīng)得到了證實；MHC 基因的高度多態(tài)性說明了遺傳背景的多樣性，可能是動物抵御不利環(huán)境的一種適應性表現(xiàn)。 通過MHC的遺傳變異分析可以提供物種的遺傳多樣性水平、種群遺傳結構、進化歷史及種群動態(tài)等信息【2】。

HLA I類基因根據(jù)編碼產(chǎn)物的組織分布、功能及多態(tài)性不同可分為經(jīng)典MHCI類和非 經(jīng)典MHCI類基因。經(jīng)典MHCI類基因(classical class I gene又稱 HLA—Ia，包 括 HLA—A、B、C三個功能基因，具有高度多態(tài)性，編 碼產(chǎn)物廣泛分布在所有有核細胞表面。 非經(jīng)典MHC I類基因 (non—classical class I gene)，即 HLA -IIb，包括 HLA-E、F、G三個座位。HLA-IIb基因的編碼及分子特點和功能也見報道【3】。

動物簡介

營養(yǎng)成分

生物學特性

遺傳信息

實驗儀器

測試流程

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